Der 1970 in der Steiermark geborene Schauspieler absolvierte ein Schauspielstudium am Max-Reinhardt-Seminar Wien. Seine Engagements führten ihn an verschiedene deutsche und österreichische Theater. Von 1999 bis 2002 war er Mitglied des „Faust“-Ensembles von Peter Stein, von 2007 bis 2015 gehörte er dem Ensemble von Andreas Beck am Schauspielhaus Wien an.

Seit vielen Jahren macht Johannes Zeiler inzwischen als Film- und Fernsehschauspieler auf sich aufmerksam. So spielte er die Titelrolle in Alexander Sokurovs Drama „Faust“ (2011). Der Film feierte seine Weltpremiere im Rahmen der 68. Internationalen Filmfestspiele von Venedig, wo er den Hauptpreis, den Goldenen Löwen, gewann. In Österreich war Johannes Zeiler unter anderem in Hauptrollen in der Fernsehserie „Cop Stories“ (2012 bis 2015) und dem Kinofilm „Deckname Holec“ (2016) zu sehen. In den drei sehr erfolgreichen deutschen Kino-Komödien „Hilfe, ich hab meine Lehrerin/Eltern/Freunde geschrumpft“ (2015/2017/2019) hatte er die Rolle des Hausmeisters „Michalski“ (Regie: Sven Unterwaldt). In der ORF-Serie „Letzter Wille“ (2018) übernahm Johannes Zeiler die Hauptrolle des Erbenermittlers Paul Schwarz (Regie: Markus Engel, Gerald Liegel). 2019 war er in der erfolgreichen BBC-Serie „World on Fire“ in einer durchgehenden Rolle an der Seite von Helen Hunt zu sehen. Für das mehrfach ausgezeichnete Politdrama „Wackersdorf“ (2017, Regie: Oliver Haffner) wurde Johannes Zeiler 2019 für den Deutschen Schauspielerpreis und den Preis der Deutschen Filmkritik als „Bester Darsteller“ nominiert.
In der erfolgreichen Netflix-Serie „Das letzte Wort“ (Streamingstart 2020) spielte er mit Anke Engelke ein Ehepaar unter sehr besonderen Umständen. Zuletzt stand er 2020/21 für die Netflix-Serie „Kitz“ in den Alpen vor der Kamera.

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